Inhibidor presente en la prueba covid significa
Reprints and PermissionsAbout this articleCite this articleShrivastava, P., Jain, T. & Kumawat, R.K. Direct PCR amplification from saliva sample using non-direct multiplex STR kits forensic DNA typing.
Sci Rep 11, 7112 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-86633-0Download citationShare this articleAnyone you share the following link with will be able to read this content:Get shareable linkSorry, a shareable link is not currently available for this article.Copy to clipboard
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PCR indirecta
La PCR directa (dPCR) es un método de amplificación del ADN directamente a partir de una muestra de tejido animal o vegetal sin realizar pasos de aislamiento y purificación del ADN. Esta técnica reduce en gran medida el tiempo experimental y el coste en proyectos de genotipado y de gran volumen. También proporciona una mejor opción cuando se enfrentan a los desafíos de amplificar una cantidad muy pequeña de muestra donde el paso de purificación podría potencialmente conducir a la pérdida de la muestra.
En muchos aspectos, la dPCR funciona como la PCR convencional. Ambas técnicas dependen del ADN molde, los cebadores y una mezcla maestra o reactivos de PCR, y ambas utilizan un termociclador para la amplificación. La principal diferencia entre la dPCR y la PCR convencional son los tampones adaptados que se utilizan en la dPCR. Los elementos modificados de la dPCR permiten una amplificación robusta a pesar de la presencia de inhibidores de la PCR que suelen encontrarse en las muestras crudas.
Se han publicado varios artículos en los que se describen las técnicas de dPCR y las modificaciones de dichas técnicas en circunstancias especiales. «A rapid and inexpensive method for the direct PCR amplification of DNA from plants» (Un método rápido y económico para la amplificación directa del ADN de las plantas) ofrece excelentes detalles sobre la configuración experimental en condiciones habituales.
Protocolo de tampón de lisis de PCR directa
El Tissue Direct PCR Kit incorpora un novedoso sistema de tampón que lisan eficazmente el tejido y neutralizan los inhibidores. Basta con tomar pequeños trozos de tejido (5-10 mg) e incubarlos con el Tampón T1 a temperatura ambiente o a 56°C durante 10 minutos para lisar el tejido y liberar el ADN. Tras una incubación de 3 minutos a 95°C, la muestra está lista para la amplificación por PCR.
Figura 1. Tratamiento de las muestras de cerdo, pollo y pescado con el kit E.Z.N.A.® Tissue Direct PCR y amplificación utilizando el ADN como plantilla respectivamente, los productos de PCR al 12% se cargaron en un gel de agarosa al 1%. M: marcador de ADN DL2000, C1: control positivo, C2: control negativo, utilizando ddH20 como plantilla.
Figura 2. Tratamiento de la muestra humana con el kit de PCR directa en tejido E.Z.N.A.® y amplificación utilizando el ADN como plantilla respectivamente, los productos de PCR al 10% se cargaron en un gel de agarosa al 1%. M: marcador de ADN DL2000, C1: control positivo, C2: control negativo, utilizando ddH20 como plantilla.
Desafíos en la PCR
Los ácidos nucleicos utilizados para los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) suelen extraerse por el método del fenol-cloroformo o por una purificación rápida alternativa. El método de tiocianato de ácido-guanidinio-fenol-cloroformo para la extracción de ARN y la proteinasa K …más
Los ácidos nucleicos utilizados para los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) suelen extraerse por el método del fenol-cloroformo o una purificación rápida alternativa. El método de tiocianato de ácido-guanidinio-fenol-cloroformo para la extracción de ARN y proteinasa K …más